c-Myc 靶向小分子干扰 RNA 抑制人直肠癌

 

Colo320 细胞增殖的实验研究

 

黄浩 ,冫余 欣¹ ,余南才 ,刘倩 ,易艳东 ,马威

 

武汉第一医院中心实验室, 武汉 430022 ,湖北;¹华中科技大学人类基因组研究中心,武汉 430074 ,湖北

 

摘要 目的 :利用小分子干扰 RNA(siRNA)技术抑制人直肠癌 Colo320 细胞 c-Myc 基因的表达 。为研

 

究 c-Myc 基因在人直肠癌 Colo320 细胞中的作用提供一个新的方法 。方法:设计人直肠癌Colo320 细胞基因特异性小分子干扰 RNA ,用体外转录方法合成

 

人直肠癌 Colo320 细胞基因的小分子干扰 RNA 并转

 

染人直肠癌Colo320 细胞,培养 48 ～ 96 h 后 ,收集细胞RNA 应用实时荧光定量 RT-PCR 方法检测转染细胞中 c-Myc 基因 mRNA 水平变化 ,Western blot 检测

 

C-MYC 蛋白的表达, 四甲基偶氮唑蓝(MTT 法)和集落形成实验检测细胞增殖活性 。结果:转染 siRNA

 

后,与对照组相比, 实验组 pGensil-c-Myc-1-4 的 c-

 

Myc 基因 mRNA 水平明显降低 ,MTT 法和集落形成

 

实验表明实验组的增殖速率明显低于对照组的增殖

 

速率 。结论 :在人直肠癌 Colo320 细胞中存在 RNA 干扰的机制, 特异性 siRNA 能够有效的抑制 c-Myc 基因的表达,为研究 c-Myc 基因在肿瘤细胞中的调节途径提供了一个新的方法。

 

关键词 小分子干扰 RNA ;人直肠癌;c-Myc 基因

 

中图分类号:R965 .2;R966

 

文献标识码:A

 

文章编号:1009-2501(2006)11-1301-04

 

原癌基因 c-Myc 的蛋白产物是一种 DNA 磷酸化蛋白质, 是调节细胞生长分化的重要转录激活因子。许多研究表明 c-Myc 基因表达失控在肿瘤发生中起关键作用^{[ 1 , 2]} 。已经证实人直肠癌Colo320 细胞

 

2006-06-02 收稿   2006-06-29 修回

 

湖北省技攻关计划项目(№2006AA301B66-3)

 

黄浩, 男, 博士, 主治医师, 从事病原生物学与肿瘤分子生物学研究。 Tel :027-85855908-455 E-mail :whhuanghao10 @yahoo .com .cn

 

 

存在 c-Myc 基因高表达^{[ 3]} 。RNA 干扰(RNA interfer-ence , RNAi)能特异性抑制基因表达, 是一种转录后基因表达调控机制, 目前已被广泛用于功能基因组和基因治疗的研究。本研究采用体外合成的小分子干扰抑制人直肠癌 Colo320 细胞中内源性的表达 ,为研究 c-Myc 基因人直肠癌 Colo320 细胞的调节途径提供一个新的方法。

 

1        材料与方法

 

1  .1  细胞培养 人直肠癌 Colo320 细胞购自武汉大

 

学生命科学院 ,培养于含 10 %小牛血清的 DMEM 培养液中 ,37 ℃、5 %的 CO2 条件下培养, 0 .3%的胰酶

 

消化和传代。

 

1 .2 siRNA 合成和真核表达载体的构建 根据 c-Myc 基因序列(GenBank NM 002467)siRNA 设计规则设计四对 siRNA , 设计基因靶点分别于 c-Myc 基因序列的第 600 、720 、1734 、1762 位点 , 靶序列分别

为  :MYC1 AACTATGACCTCGACTACGAC , MYC2AAG AAATTCGAGCTGCTGCCC , MYC3 AAGGCCCCCAAGG

TAGTTATC , MYC4 AAGCCACAGCATACATCCTGT 。 另设计一对对照 siRNA , 由武汉市晶赛生物技术有限公司合成(图 1)。将 siRNA 经 BamH Ⅰ 、Hind Ⅲ双酶切插入真核表达载体pGenesil-1 构建的表达质粒 ,称

 

为 :pGensil-c-Myc-1 、pGensil-c-Myc-2 、pGensil-c-Myc-3 、 pGensil-c-Myc-4 、pGensil-c-Myc-HK 。

 

 

 

 

 

 

 

 

图 1  真核表达载体 pGenesil-c-Myc-1-4 的构建示意图

· 1302 ·

 

1 .3 阳离子聚合物(梭华 -Sofast TM DNA 试剂盒)介导的细胞转染 细胞培养至 40 %～ 60 %汇

 

合 ,配制不同浓度的 pGensil-c-Myc-1-4(浓度为 5 、 7 .5、10 、12 .5、15 ml^-1 )梭华-Sofast TM DNA 复合物 ,

进行转染 ,具体操作步骤见试剂盒说明书。

 

1 .4  集落形成实验 取以上各组转染细胞培养

 

48 h ,悬于 40 ℃预热的 10 %FCS 的 DMEM 培养基

 

中,接种于 24 孔培养板, 吸取预热的 1 .2%琼脂 125 μl,于 24 孔板中混匀 。自然凝固后, 置 37 ℃、 5 %CO2 孵箱中培养8 ～ 10 d , 取软琼脂层,置于载玻

 

片上, 镜下观察到细胞数在 50 个以上为一集落 , 计算集落形成率。

 

1 .5  MTT 法检测细胞增殖 收集以上各组转染细

 

胞 ,用含 10 %小牛血清的培养液配成单个细胞悬液,调整细胞密度为 1 .0×10⁵ ml^-1 接种到 96 孔板 ,

置 37 ℃、5 % CO2  培养 4 h , 每孔加 MTT 溶液

 

(5 mg·ml^-1 )20 μl 继续孵育 5 d , 终止培养 , 弃孔内上清液。每孔加 100 μl DMSO ,振荡 10 min , 使结晶物充分融解 ,540 nm 各孔光吸收值, 连续检测 5 d , 以时间为横坐标 ,吸光度值为纵坐标绘制生长曲线 。 1 .6 逆转录反应 离心收集各组转染细胞, 预冷

 

PBS 洗涤 1 次后 ,用 Trizol 一步法提取细胞总 RNA ,

 

取 1 μg 细胞总 RNA ,加入Oligo primer (0 .5μg·μl^-1) 1 μl, Deionized water 12 μl 离心混匀 , 70 ℃ 5 min 。

 

0 ℃冰水浴立刻终止, 离心 。加入 5 ×reaction buffer

 

4   μl、Ribonuclease inhibitor (20 U·μl^-1 )1 μl、dNTP mix (10 mol·L ^-1 )2 μl 离心混匀 , 37 ℃ 5 min , 再加 Re-verse Transcriptase (200 U·μl^-1 )1 μl, 42 ℃ 60 min ,

 

再 70 ℃,10 min 。0 ℃终止后 ,cDNA 冻置-20 ℃。

 

1 .7  荧光定量检测 c-Myc 的 mRNA 的表达  采用

 

SYBR Green 荧光染料法针对 C-MYC 的 mRNA 进行 Real-time PCR 检测, 吸取逆转录反应产物 10 μl 引物上下游各 2 μl, master mix 10 μl、ddH2O 为 4 μl、

 

ROX reference dye 1 μl, 预变性 95 ℃ 10 min 、94 ℃ 10 s 、56 ℃ 30 s 延伸 72 ℃ 30 s , 35 次循环 , 72 ℃

 

5 min 。设置阴性对照和 β-action 内参 , 引物序列 :

 

 

Chin J Clin Pharmacol Ther 2006 Nov ;11(11)

 

 

2        结果

 

2 .1  转染 siRNA 后细胞增殖状况

 

2 .1.1  MTT 法检测转染细胞和对照细胞的生长曲

 

线 可以看出转染了 pGensil-c-Myc-1-4 各组的细胞增殖较对照组细胞增殖慢(吸光度曲线上升明显),

 

d   3 时抑制效果最明显 , 其中转染 pGenesil-c-Myc-4

 

最显著。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图 2   MTT 法测定细胞生长曲线

 

2 .1.2 集落形成实验 集落形成实验显示对照组细胞与MYC-HK 组细胞形成的集落直径大 ,细胞饱满、间隙小、生长旺盛。而转染组细胞的细胞集落直径明显小于对照组 , 细胞间隙大 、生长抑制明显(图

 

3 、4)。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图 3  正常人直肠癌 Colo 320 细胞 24 h 后细胞集落形态(×

 

100)

 

F5' -AGCTGCTTAGACGCTGGATTT-3 ' R5 '-CGAGGT-CAAGTTCCTGTTGGT-3' 。

 

1 .8 Western-blot 定量检测 C-MYC 蛋白 转染细胞如 1 .3,收集转染及正常的细胞 , 裂解液裂解 , 取

 

20   μl裂解样品液, 进行SDS-PAGE 蛋白电泳, 表达产物电转移至硝酸纤维素膜上 , 进行 Western-blot 反

 

应 ,通过 Band Scan 5 .0 软件对杂交图进行分析 , 以 β-actin 做为定量Maker ,20 pmol 为定量单位 。

 

 

 

 

 

图 4 转染了 pGensil-c-Myc-1-4 Colo 320 细胞24 h 后细胞集落形态(×100)

 

 2.2  荧光定量 PCR 检测 c-Myc的 mRNA 变化

 

中国临床药理学与治疗学 2006 Nov ;11(11)

 

分组情况如下:①β-actin ;②对照组 ;③pGensil-c-Myc-HK 组;④pGensil-c-Myc-组 ;⑤pGensil-c-Myc-2 组;⑥ pGensil-c-Myc-3 组 ;⑦pGensil-c-Myc-4 组;⑧阴性组 。 Colo320 细胞转染 pGensil-c-Myc-1-4 , 24 h 后收集细胞抽提总 RNA 应用荧光定量实时 RT-PCR 来检测转染组与对照组 c-Myc 的 RNA 水平的变化 ,并计算各浓度组抑制率, 转染 pGensil-c-Myc-1-4 各组平均 ct 值分别为 28 .23 、30 .12 、32 .43 、34 .65 , 转染 pGensil-c-Myc-HK 和对照细胞 ct 值分别为 25 .31 、26 .35 , 结果表明转染了 pGensil-c-Myc-1-4 各组的C-MYC 表达水平比对照组明显降低, 4 个不同的 siRNA 其抑制效果有差别, 转染 pGensil-c-Myc-4 抑制效率最高(图

 

5)。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图 5  各组转染细胞实时荧光定量 PCR 动态扩增曲线结果

 

①β-actin ;②对照组;③pGensil-c-Myc-HK 组;④pGensil-c-Myc-组;⑤ pGensil-c-Myc-2 组;⑥pGensil-c-Myc-3 组;⑦pGensil-c-Myc-4 组;⑧阴性

 

组

 

2 .3  Western-blot 检测 C-MYC 蛋白  由图6 可知 ,

 

没有转染的正常 Colo320 细胞和转染了 pGenesil-c-Myc-HK 、pGenesil-c-Myc-1-4 质粒的Colo320 细胞均可

 

在 43 KD 的 β-actin Maker 略下方可见清晰杂交带 。我们将没有转染的正常Colo320细胞与转染12.5μg·ml^-1

时的 pGenesil-Myc-HK 、pGenesil-c-Myc-1-4 的 24 h 后 Western-blot 杂交图进行 Band Scan 5 .0 软件分析, 以 β-actin 为内参定量 Maker , 得出结果分别为 11 .84 、 11 .32 、1 .14 、4 .43 、1 .14 、0 .51 , 转染了四种真核表达的质粒的细胞表达Myc 的蛋白量均显著降低, 其中转染 pGenesil-c-Myc-4 最显著 。

 

 

 

 

 

 

 

图 6  各种质粒转染 12.5 μg·ml^-1 时 Western-blot 杂交图

 

· 1303 ·

 

 

3        讨论

 

有关原癌基因与细胞周期调控的研究是近年来细胞生物学研究的热点之一 ,取得了令人瞩目的成绩 。c-Myc 是目前研究较多的原癌基因之一, 编码关键性调控蛋白, 在生理状态下不表达或仅限制性低表达 ,参与调控正常细胞的增殖和分化 ;在受到异常刺激激活后,其出现高表达, 导致细胞生长 、分化凋亡等异常改变, 与许多肿瘤的发生和发展有关^{[ 4]} 。

 

哺乳动物细胞 RNA 干扰机制的发现为基因功能的研究提供了一个新的方法, 目前已被广泛用于功能基因组和基因治疗的研究。本研究以 c-Myc 为靶基因 ,根据 Elbashir 等^{[ 5]} 提出的设计原则 ,设计了 4 条 siRNA 序列,并成功克隆至空载体 pGenesil 中构建重组体 pGensil-c-Myc-1-4 , 进而将 c-Myc 特异性 siRNA 转染入人直肠癌Colo320 细胞中 ,利用MTT 法测定转染了 pGensil-c-Myc-1-4 各组细胞的生长曲

 

线 ,结果显示转染 pGensil-c-Myc-1-4 各组细胞的增殖活性明显降低。通过集落形成实验观察细胞集落形成 , 结果也显示对照组细胞与Myc-HK 组细胞形成的集落直径大, 细胞饱满、间隙小、生长旺盛 。而转染组细胞的细胞集落直径明显小于对照组 ,细胞间隙大 ,细胞增殖受到抑制 ,这些实验结果表明通过抑制 c-Myc 的表达可以抑制细胞的增殖。

 

同时 ,我们运用实时荧光定量 PCR 检测了转染 pGensil-c-Myc-1-4 各组的 C-MYC 表达水平 。结果发现 , 四个不同的 siRNA 其抑制效果有差别。 通过

 

Western blot 及 Band Scan 5 .0 软件分析了转染 5 、 7 .5、10 、12 .5、15 ml^-1 各种浓度的 pGenesil-c-Myc-1-

4 ,将结果与对照组比较 ,发现表达 C-MYC 蛋白量差异均有统计学意义 。转染 pGenesil-c-Myc-4 组的 C-

 

MYC 蛋白量降低最为显著 ,转染各种浓度的质粒的 C-MYC 蛋白表达量均明显下降, 进一步证实了我们构建的 4 种 shRNA 真核表达载体均有效 , 其中 pGenesil-Myc-4 的作用最好。

实验中还发现转染的 siRNA 的转染效率随 siR-NA 浓度的增加而升高 , 但增加到 50 pmol 其抑制率最高,再增加 siRNA 浓度对其抑制率无显著影响 。

 

本研究成功地构建了 siRNA 重组体 pGensil-c-

 

Myc-1-4 并在转染人直肠癌 Colo320 细胞后能显著抑制细胞和 c-Myc 表达 , 研究同时也证明在人直肠癌

 

Colo320 细胞中存在 RNA 干扰的机制 ,特异性 siRNA

 

能够有效地抑制 c-Myc 基因的表达。这为下一步诱导其对化疗药物的敏感性以及动物体内实验提供了

· 1304 ·

 

理论及实验基础 ,为人直肠癌的生物治疗探索了一条新的途径。

 

参考文献

 

1   Fire A , Xu S , Montgomery MK .Potent and specific genetic in-terference by double-stranded RNA in Caenorhabditfs elegans

 

[ J] .Nature , 1998;391:806 -11

 

2   Mello CC, Conte DJ.Revealing the world of RNA interference

 

 

Chin J Clin Pharmacol Ther 2006 Nov ;11(11)

 

[  J] .Nature , 2004;431 :338-42

 

3   Jemal A , Tiwari RC .American Cancer Society :Cancer statistics

 

[  J] .Cancer J Clin, 2004;54 :8-15

 

4      张宝春, 单易非.c-Myc 反义寡核苷酸对白血病细胞凋亡

 

的影响[ J] .复旦学报(医学科学版), 2001;28 :13-6

 

5  Sui G , Soohoo C, Affar el B , Gay F , Shi Y , Forrester WC, et al .A DNA vector-based RNAi technology to supress gene ex-

 

pression in mammalian cells[ J] .Proc Natl Acad Sci USA , 2004 ;55:15-20

 

 

Use siRNA targeting gene c-Myc to inhibit cellular proliferation in human rectal cancer Colo320 cell line

HUANG Hao , TU Xin¹ , YU Nan-cai , LIU Qian , YI Yang-dong ,MA Wei

 

Center of Experimental Medicine , Wuhan First Hospital , Wuhan 430022 , Hubei , China ;¹Human Genome Research Center , Huazhong University of Science &Technology , Wuhan 430074 , Hubei , China

 

ABSTRACT AIM :To inhibit c-Myc gene expression in human rectal cancer cell line Colo320 by small interfer-

 

ing RNA (siRNA), and to provide a new method to study

 

the role of c-Myc in Colo320 cell .METHODS:The c-Myc gene specific siRNA was designed according to its se-

 

quence and made by in vitro transcription .The c-Myc

 

siRNA was transfected into Colo320 cell , and the cell was cultured for 48 to 96 hours before harvesting .c-Myc mR-

NA and protein level were monitored by using fluorescence

 

 

Compared with control group , there was a significant de-crease in the c-Myc mRNA .Colo320 cells transfected

 

with c-Myc siRNA had lower cellular proliferation than

 

no-transfected Colo320 cells .CONCLUSION :Our re-sults suggest that there exist RNA interference mechanism

 

in Colo320 cell line , and the c-Myc siRNA can specifi-

 

cally inhibit the expression of c-Myc gene in Colo320 cells.RNA interference method provides a new way to

study the role of c-Myc in cancer cell .