RP-HPLC法测定不同产地木蝴蝶中黄芩苷的含量

易艳东*, 马威,黄浩,林世和，余南才

(武汉市第一医院实验中心, 湖北武汉，430022)

摘要：　目的 建立测定木蝴蝶中黄芩苷含量的方法。方法 采用HPLC 法对测定木蝴蝶中黄芩苷进行含量测定,Microsorb-MV100-5C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇－水－磷酸(47∶53∶0.2);检测波长280nm。结果 黄芩苷在1.01～5.06μg范围内与峰面积呈良好的线性关系,其回归方程为:A=2449.5X+125.9（r＝0.9994）,平均回收率为101%(n=5) ,RSD为0.70%。结论 本方法简便、准确、重现性好,可作为木蝴蝶饮片质量控制标准。

关键词:  木蝴蝶;黄芩苷;高效液相色谱法

Determination of baicalin in Oroxylum indicum Vent by RP-HPLC

YI Yan-dong; MA Wei; HUANG Hao;Lin Shi-he；YU Nan-cai

（Center of Experimental Medicine; Wuhan First Hospital; Hubei Wuhan; China）

Abstract :Objective  To establish the determination on baicalin of Oroxylum indicum Vent . Method  HPLC was applied , Microsorb-MV100-5C₁₈ (250mm×4.6mm,5μm) for column , methanol-water-phosphoric acid (47∶53∶0.2) formobile phase , detective wave 280nm. Results The linear range of baicalin was 1.012 to 5.6μg, r =0.9994. The regression equation was A=2449.5X+125.9,the average recovery was 101%(n=5) ,with RSD＝0.38 %. Conclusion  The method is accurate and the reproducibility is good , and it could be used for the determination of baicalin in Oroxylum indicum Vent.

Key words : Oroxylum indicum Vent; Baicalin; HPLC

木蝴蝶为紫葳科植物木蝴蝶Oroxylum indicum (L.)Vent1 的干燥成熟种子。性味苦、甘、凉;归肺、肝、胃经;具有清肺利咽、疏肝和胃功效^[1]。黄芩苷为木蝴蝶饮片抗炎、抗菌、清肺利咽作用的主要化学成分^[2]。《中国药典》2005年版一部中木蝴蝶项下未有含量测定项,本文采用RP-HPLC色谱法对木蝴蝶饮片中的黄芩苷含量进行了测定,以期为制定木蝴蝶的质量控制标准提供参考。

1、仪器与试药  varian高效液相色谱仪（美国）；木蝴蝶饮片来源见表1, 经实验中心余南才主任鉴定为Oroxylum indicum (L.)Vent；黄芩苷（中国药品生物制品检定所，批号0715-9909）；乙腈为色谱纯，水为纯化水，其余试剂为分析纯。

2、方法与结果

2.1色谱条件  色谱柱：Microsorb-MV 100-5 C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),柱前加保护柱；柱温30℃；乙腈-水（含0.2％磷酸）（21：79）为流动相，流速1ml/min；检测波长为280nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000。在上述色谱条件下，样品中黄芩苷峰形良好，且与相邻峰的分离度大于1.5，符合中国药典的要求。

2.2 对照品溶液制备及线性关系考察  精密称取在60℃减压干燥4h的黄芩苷约5mg，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。用微量注射器分别吸取2、4、6、8、10μl的对照品溶液注入色谱仪，进行分析测定，以黄芩苷的进样量为横坐标，峰面积值为纵坐标作图，绘制标准曲线，计算得回归方程：A=2449.5X+125.9（r＝0.9994）。结果表明：黄芩苷进样量在1.012～5.06μg范围内，呈良好的线性关系。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取木蝴蝶粉末（过30目）0.5g置锥形瓶中，加甲醇50mL，称定重量，超声75分钟，放冷，补足重量，取上清液滤过（0.45μm），即得。

2.4 精密度试验 精密吸取同一对照品以及供试品溶液10μL，连续进样5次，测定黄芩苷峰面积值，RSD分别为1.27%、1.12％，表明测定精密度良好。

2.5 重复性试验  精密称取同一批样品0.5g，共5份，按供试品溶液的制备和样品测定方法测定，结果见表5。结果RSD =0.7%,表明重复性良好。

2.6  稳定性试验  取样品溶液，在0、2、4、6、8h测定黄芩苷峰面积，结果RSD =1.67%，表明样品溶液在8h内稳定。

2.7加样回收率试验  精密称取本品粉末（过30目）约0.5g，共6份，分别加入黄芩苷对照品，按标准中含量测定的方法进行处理测定黄芩苷的含量，并计算黄芩苷的回收率，结果平均回收率为101％，RSD＝1.7％。

2.8 样品测定及含量限度的确定  分别取不同批次的饮片粉末（过二号筛）约0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，照标准中含量测定的方法进行测定，测得各批次的含量见表1。

表1  样品中的黄芩苷含量测定

Table 1　Determination of  baicalin in Oroxylum indicum 

根据以上测定结果，将木蝴蝶饮片中黄芩苷的含量限度定为干燥品计算，含黄芩苷不得少于3.0%。色谱图见图1。

图1　对照品(A)和样品(B)色谱图

Fig1　Chromatogram of reference substances (A) and samples (B)

3 讨论

3.1 黄芩苷含量测定方法的选择 文献报道有分光光度法[3]、薄层扫描法[4]、高效液相色谱法[5] ,本文木蝴蝶饮片黄芩苷含量测定中采用HPLC 法。采用HPLC 法测定木蝴蝶饮片中黄芩苷含量,该方法操作简单,结果准确,重现性好,可作为木蝴蝶饮片及其复方制剂质量控制标准。

3.2 提取溶剂的选择  供试品提取溶剂及对照品稀释溶剂的选择原方法样品取样量为2 g,用乙醇30 ml提取,黄芩苷对照品也是用乙醇溶解。但实际上黄芩苷难溶于乙醇,故用乙醇提取效果不佳。黄芩苷用甲醇作溶剂能完全溶解。实验比较了黄芩苷的70%乙醇、50 %乙醇、50 %甲醇、甲醇为溶剂提取,结果表明,采用甲醇提取法指标成分黄芩苷提取完全;甲醇－水提取法所得图谱未见黄芩苷峰,此现象有待于进一步深入研究。

3.3提取方法及提取时间的选择  实验比较了黄芩苷的回流提取和超声提取两种方法,结果表明效果回流提取差于超声提取方法,故选用超声提取回流提取方法。对于本品含量测定的提取方法及提取时间的确定，根据参考文献，分别采用了回流提取和不同时间的超声波提取，结果见表2。

表2  提取方法及提取时间对含量影响结果(%)

Table 2  Extraction and extraction time on the content(%)

根据以上实验结果，确定采用超声波提取75min作为含量测定的提取方法。所用超声波的功率为250w，频率33KHz，本提取方法既可避免因长时间加热提取而使黄芩苷发生结构上的改变，并能提取完全。

3.4 流动相的选择 曾用甲醇－水－磷酸(39∶61∶0.2) 、甲醇－水－磷酸(44∶56∶0.2)、乙腈－水－—磷酸(20∶80∶0.2)。结果前二个流动相黄芩苷峰分离度不好,而第三个流动相分离效果好,因此确定流动相为乙腈－水－磷酸(20∶80∶0.2)。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].2005年版.二部.北京:化学工业出版社,2005：143～44.

[2]Zhang XP,Tian H,Cheng QH.The current situation in pharmacological study on baicali[J]. Chinese Pharmacological Bulletin,2003,19(11):1212～1215.

[3] 卢利军,刘丽萍,刘泊. 紫外分光光度法测定柴黄片中黄芩苷的含量[J]. 甘肃中医 , 2008,21 (01)：49～50.

[4]丁元晶,王永忠,庄乾文.清咽利喉片的质量控制[J].中国医院药学杂志,2007,27(04)：487～490.

[5]陈菲,盛柳青,邱姣英.不同厂家清热解毒口服液中黄芩苷含量的比较[J].中医药导报 , 2008,14 (01)：63～64.