马齿苋俗名长寿菜，始载《蜀本草》，为一年生肉质草本植物，其茎叶均可利用，干、鲜均既能食用又可入药，有着几千年的药、食历史。资源丰富，广泛分布于我国南北各地，生长于田间、道旁、庭院，夏秋采收。马齿苋味酸性寒，清热解毒，散血消肿，凉血止血，适用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血、崩漏下血等症[2]。现代药理研究证明，马齿苋在机体脂代谢、抗氧化、免疫功能等方面具有很强的药理作用[3]。马齿苋全草中含多糖、总黄酮、鞣酸、脂肪酸、生物碱、挥发油等多种具有药理作用的活性成分[4]，新鲜马齿苋有促进伤口愈合的作用，其疗伤作用与库拉索芦荟治疗大鼠（胶原性）皮肤损伤的作用相似，可能作用于伤口治疗过程中的纤维形成、胶原合成和伤口收缩等多个阶段[5]。

余南才课题组通过建立D-gal诱导的脑神经毒性损伤小鼠模型，观察了不同浓度马齿苋水提液灌胃对脑损伤小鼠的保护作用；通过分子生物学方面的相关研究，分析马齿苋的生物活性；通过旷场实验和避暗实验，观察了马齿苋水提液对模型小鼠的学习和记忆能力；为进一步探寻马齿苋水提液对小鼠的脑神经保护机制，在D-gal诱导的脑神经毒性损伤小鼠模型的基础上，应用ELISA、ELISA-PCR、Southern blot、荧光定量PCR、Western blot等技术检测各组小鼠脑组织SOD、MDA含量、组织端粒酶活性、端粒长度、脑组织p21waf1、p53基因和蛋白表达，探讨马齿苋水提液对D-gal诱导的脑神经毒性损伤小鼠，脑组织端粒酶活性表达、端粒长度的影响。分析马齿苋水提液对脑组织p21waf1、p53的mRNA和表达蛋白的变化的影响，探讨马齿苋水提液通过何种机制调节脑组织端粒酶活性表达、端粒长度。通过各自肝、脑形态学的图像分析对形态学改变；从p21waf1的p53依赖与非依赖途径的调控角度，阐明马齿苋水提液抗D-gal诱导的脑神经毒性损伤及保护脑神经作用的可能分子机制，研究思路示意图如下。

研究结果提示：马齿苋水提液具有较强脑神经的保护作用。p21waf1很可能是马齿苋水提液作用的一个靶点，而这种调控作用，极有可能是通过p53非依赖途径的调控进行。

二、鲜马齿苋抗衰老药理研究及作用机制

采用腹腔注射D-半乳糖制成衰老小鼠模型，随机将模型小鼠分为低、中、高3个浓度组和模型组，另设正常对照组。低、中、高浓度组在标准饲料基础上，每日每只分别灌胃2.5g·mL-1，5.0g·mL-1，10.0g·mL-1马齿苋水提液0.4mL，饲喂4周后，用聚合酶链反应－免疫酶联吸附试验法检测衰老小鼠脑组织端粒酶活性；用端粒限制性片段Southern blot法检测脑组织端粒长度变化；并荧光实时定量PCR法检测脑组织e-myc和p53基因mRNA的表达；Western blottir检测脑组织C-MYC和P53的蛋白表达来探讨马齿苑水提液保护衰老小鼠DNA端粒长度缩短的作用机制；图像分析对肝、脑形态学改变。

2.实验方法

2.1模型制备及分组：D-gal用0.9% 生理盐水稀释成50mg·mL-1浓度，将SD小鼠随机分为5组，第2－5组500mg/(kg· day) 腹腔注射, 连续8周。第1组为对照组仅注射生理盐水。造模后，第3－5组每日每只分别灌胃2.5g·mL-1、5 g·mL-1、10 g·mL-1马齿苋水提液1mL，连续8周。第1-2组每日每只灌胃同体积的蒸馏水。以上剂量均按动物与人给药剂量的常规换算方法制定。

2.2.对行为学能力的影响

2.2.1旷场实验  旷场实验箱为(38 cm×20cm×24 cm)的箱体，箱底画有25个相等方格。把制作好的open field放在光线充足的地方，在底面放一块透明玻璃，把各组小鼠分别放进open field边缘，让小鼠自由爬行，并录下小鼠在open field里面5分钟的行为表现，实验结束将小鼠放入开阔箱的正中格内，观察小鼠5分钟的活动情况。测定指标包括：(1)正中央格停留时间；(2)方格间穿行时间；(3)竖起或修饰时间(两前肢离地1cm以上的时间)。

2.2.2.避暗实验  实验装置分为明暗两室，两室之间有一直径为3 cm的圆洞，暗室底部铜栅通电。训练时先将小鼠放入反应箱中适应3 min，然后暗室底部铜栅通以40 V、50 Hz交流电，将小鼠背对洞口放入明室，小鼠进入暗室即受电击。训练时潜伏期大于180 s者弃去不用。用药后第1、2、3、5天将小鼠再次放入明室，记录第1 次进入暗室的时间(潜伏期)和5 min内进入暗室的次数(错误次数)。如果5 min内小鼠未进入暗室，错误次数记为0次，潜伏期记为300s。

2.3.SOD的活性检测   按照McCord and Fridowich建立的方法，配制混合液A (PBS50mM(pH 7.4)100mL，0.1mMEDTA，2μmol细胞色素c, 10 ml 0.001N NaOH, 2μmol黄嘌呤)；配制溶液B混合液（0.1mMEDTA，0.2U黄嘌呤氧化酶）。取各组小鼠脑组织上清液50μL混合2.9 mL溶液A，反应开始在加入50μL溶液B，550nm下测定各组小鼠吸光度，SOD蛋白水平以U/mg表示，以已知标准的牛Cu-Zn SOD在相同情况下的吸光度作为标准曲线。

2.4MDA水平的检测   按照McCord和Fridowich建立的方法，0.5ml的匀浆脑组织加入3mL1%的H3PO4，1mL0.67%的硫代巴比土酸，加热水浴45min，混合物用n-丁醇提取，532nm下测定各组吸光度，MDA水平以nmol/mg表示，以已知标准的在相同情况下四甲氧基丙烷的吸光度作为标准曲线。

2.5 RT-PCR检测p21 waf1，p53的mRNA表达

2.5.1总RNA提取：脑组织收获后以2000rpm离心10分钟；加入1mLTRIzol 试剂，混匀后放置30分钟；将液体移至1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心10min。转移上清入一新离心管中，室温下放置5min；加入氯仿，用力振荡，室温下放置3min。4℃下12000rpm离心15min；转移上清入一新离心管中，加入异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温下放置10min。4℃下12000rpm离心10min；弃去上清，缓慢加入75%乙醇5mL，轻轻颠倒洗涤离心管管壁，弃去乙醇；再加入75%乙醇10mL，4℃下8000rpm离心10min；弃去上清，在超净工作台中干燥沉淀5min，加入Milli-Q水（Rnase-free）完全溶解沉淀，-80℃冻存。

2.5.2.逆转录合成cDNA第一链：逆转录过程使用逆转录试剂盒进行（Promega），具体如下：取7μL（2-10ug）步骤1提取的RNA，加入1μL Oligo d（T）15，5μLDEPC处理水，72℃保温10min后置于冰上。然后加入4μL 5×M-MLV buffer，1μL dNTP（10mM），200U M-MLV 逆转录酶，40U RNA酶抑制剂，42℃保温60min。之后94℃变性10min，冰上放置10min。所得产物-20℃备用。

2.5.3Real-time PCR检测：采用荧光染料法针对c-myc mRNA进行Real-time PCR 检测，试剂盒为QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit (Qiagen Ltd)，总体积20μL，其中Realtime master mix 10μL，cDNA模板2μL，正向和反向引物各0.4μL（10uM），加水至总体积20μL，加入到Realtime PCR毛细玻璃反应管中，于Roche Lightcycler1.5实时定量PCR仪(Roche Diagnostics Ltd., Lewes, UK)中反应。p21waf1引物序列为(forward：CCCGAGAACGGTGGAACT,reverse：GTGGGCACTTCAGGGTTT)，p53(forward：CTCAAAAAACTTACCAGGGC,reverse：CACCACGCTGTGGCGAAA AGTCTG)具体步骤为：

stage 1：94℃10 second，20℃/s  1cycle ；

stage 2：94℃5 second，20℃/s ，57℃15 second，20℃/s ，72°Cfor 5 second，45cycle ；

stage 3：94℃0 second，20℃/s ，65℃  15 second，20℃/s，94℃  0 second 0.1℃/s。

基因的表达定量分析采用样品的CT值（threshold cycles），以鼠β-actin基因 (Applied Biosystems)内参计算p21waf1、p53基因表达量。realtime-PCR分别扩增目的基因和作为对照的管家基因（β-actin），每个样品待测目的基因的CT值由内参基因β-actin的CT值标准化。采用2-ΔΔCt(Comparative Ct method of Quantitation” (ΔΔCT))法进行相关数据的统计处理，根据2-ΔΔct来比较目的基因相对于管家基因的表达量，从而达到相对定量的目的。计算方法如下：

ΔCT (sample) = CT (target gene)-CT (β-actin),

ΔΔCT = ΔCT (sample)-ΔCT (control)

目的基因的相对表达水平Relative expression =2-ΔΔCt

2.6Western blot检测p21waf1，p53蛋白表达

2.6.1细胞蛋白质的提取：将样本脑组织匀浆，用预冷的PBS缓冲液洗涤2次后加入适量解液(50mMTris (pH 8.0)，150mMNaCl，5mMEDTA, 0.5% NP40,100mMPMSF, leupeptin 1 mg·mL-1, aprotinin 1 mg·mL-1, and1MDTT)，吹匀于4℃放置30min，12,000 rpm离心20 min，留取上清，取少量上清采用考马斯亮蓝法检测浓度，将所有蛋白样品调至等浓度，-70℃保存。

2.6.2Western blot：2×SDS加样缓冲液（15.1 gTris 碱，72.0 g甘氨酸，5.0 gSDS）按1：1（V/V）稀释待测蛋白质样品，于100℃煮沸3-5min，制备12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶，垂直电泳分离蛋白质，100V电泳1h，待样品中的溴酚蓝进入分离胶后，将电压调高到200V，在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。

电泳完成后，拆卸凝胶夹层，去除积层胶。以适量的转移缓冲液（4L H2O中加入18.2g甘氨酸；再加入1200mL 甲醇，并补加H2O至6L，溶液PH值约为8.3-8.4）室温平衡凝胶30min，将蛋白电转至经甲醇活化处理过的PVDF膜上，4℃，14V电转过夜；关闭电源，拆卸转印装置，取转印膜考马斯亮蓝染色确定转移效率。

2.6.3封闭及杂交  将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST（1×PBS，Tween-20，0.01%-0.02%）稍加漂洗，浸没于含5%脱脂奶粉的PBST封闭液中缓慢摇荡2小时。弃去封闭液后分别按实验需要分别加入小鼠抗体anti-p21waf1，anti-p53抗体(Santa Cruz Biotechnology)，anti-β-actin抗体作为内参，4℃摇匀过夜后，PBST溶液于室温下洗膜4次，每次5-10min；加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠-IgG二抗（1：1000），室温轻摇1小时，用PBST漂洗膜后再浸洗3次，每次5-10min。HRP-ECL发光法显色。按ECL试剂说明书(Sigma Life Science)将发光液按比例稀释混合，膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5mi左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干后进行分析与扫描。通过BandScan5.0软件对western-blot杂交图进行分析，以β-actin做为定量Maker，20pmol为定量单位。

2.7脑组织端粒长度的检测  端粒长度检测原理见下图。

2.7.1DNA提取：具操作参见Tiangen基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP303/304)说明书。

2.7.2酶切反应：配制酶混合液，Hint I/ Rsa I各7μL，加样。

2.7.3转膜：将凝胶侵泡HCLsolution，5-10min，馏水冲洗2次。将凝胶侵泡Denaturation solution，30min，蒸馏水冲洗2次。将凝胶侵泡Neutralization solution，30min转膜，戴上手套，在盘中加20×SSC 液，阳离子尼龙膜20×SSC 浸泡。准确地盖在凝胶上，除气泡。用浸过20×SSC 液的3 滤纸盖住滤膜，后加上干的3 滤纸和干纸巾，转移时用0.4mol·L-1NaOH 代替20×SSC。转移6-16h，去除纸巾等，用蓝色圆珠笔在滤膜右上角记下转移日期，做好记号，滤膜，在2×SSC 中洗5分钟，凉干后在120℃中空气干燥20min。

2.7.4杂交：42℃预热DIG Easy Hyb25mL，将转移尼龙膜放入含DIG Easy Hyb18mL的密封小塑料袋中，42℃40-60min，弃去预杂交液。加入1.3μL Telomere probe与42℃预热DIG Easy Hyb6.5mL杂交3h，42℃，弃去预杂交液。

2.7.5检测：取出滤膜，Stringent wash bufferⅠ洗膜2次，每次5min，0℃预热Stringent wash buffer 11洗膜2次，每次20min，在50℃，Washing buffer冲洗膜1-5min，100ml，cking solution封膜30min，100mL。将膜转入Anti-DlG-AP. working solution50-100mL中30min，Washing buffer（2×100）冲洗膜2次，每次15min，将膜转入Detection buffer（100mL）2-5min。弃去Detection buffer，晾干。将膜DNA面朝上，快速滴加40滴Substrate solution，避光5min，积压多余的Substrate solution，曝露于凝胶成像设置或X光片进行放射自显影。

2.8脑组织端粒酶活性的检测：用预冷的PBS缓冲液洗涤2次后加入适量裂解液，吹匀于4℃放置30min，12,000 rpm离心20 min，留取上清冰浴20 min，4℃12000 rpm / min，离心15 min，取上清2μL加入46μL 端粒酶反应液和Taq 酶1μL，25℃30 min 水浴, 每管加2μL端粒酶引物，94℃变性5min，94℃40 s，52 ℃40 s，72 ℃90 s，共30个循环，72℃延伸10 min。扩增产物与变性液混匀后，置室温10 min，取20μL加入微孔板，同时加入杂交液100μL (含1μL 端粒酶探针)，37 ℃水浴1 h，PBS洗板3 次，每孔加入100μL 酶联应用液(含1μL 酶标抗体)，37 ℃水浴1 h，PBS洗板5 次，加显色液A、B 各1 滴，显色10 min，2 mol H2SO4终止反应，450 nm 测定吸光度(A) 值。酶标板包被取10μL 亲和素，加包被液1 mL，混匀每孔加入100μL，4 ℃过夜。弃液体，每孔加250μL 封闭液，37℃2 h，甩干备用。端粒酶活性以蛋白所含的吸光度(A) 值表示。用凝胶成像分析系统测定RT-PCR、Western blot的DNA条带及蛋白条带的相对光密度值(即目的片段光密度值/内参照光密度值)，每组实验均重复3次以上。

2.9形态学观察方法　小鼠处死后,取其脑、肝组织，以干冰速冻，恒温冷冻切片机切片，固定在10%的中性甲醛液中，作常规的取材、石蜡包埋、切片，切片厚4μm，HE染色。

2.10组织图像分析　使用Image-pro plus软件，在每张切片上随机选取10个视野进行神经元计数和肝细胞核面积、核浆比的测量，根据每张切片上10个视野测的均数计算各组均数。

2.11数据处理　所有数据经Spss统计软件处理分析。数据以±s表示，以单因素方差分析，组间t检验作统计学处理，p<0.05被认为具有统计学差异。

3.实验结果

3.1马齿苋水提液对模型小鼠行为学能力的影响

3.1.1旷场实验  由图8A可知，各组模型小鼠的各项指标与对照组相比显著性减少，如①方格间穿行时间(F(4,40) = 3.12，P< 0.05)；②正中央格停留时间(F(4,40) = 2.06，P< 0.05)；③竖起或修饰时间(F(4,40) = 1.24，P< 0.05)。说明D-gal 诱导后的小鼠，都受到不同程度的脑神经毒性损伤。经过马齿苋水提液以2.5、5 和10 g·mL-1灌胃2周后，小鼠正中央格停留时间与竖起或修饰时间皆得到显著性延长(P< 0.05)。

3.1.2避暗实验  由图8B可知，实验中各组模型小鼠24小时停滞实验的潜伏期与对照组比较，显著性的减少，经过马齿苋水提液以2.5、5 和10g·mL-1灌胃2周后，24小时停滞实验的潜伏期与对照组比较，显著性的提高。

B

3.2马齿苋水提液对模型小鼠SOD活性和MDA水平的影响   由图9A可知，D-gal 诱导的神经毒性损伤会显著性降低模型小鼠脑组织Cu、Zn-SOD的活性(P < 0.05)， 模型小鼠接受马齿苋水提液治疗后，Cu, Zn-SOD活性会显著性增加，马齿苋水提液浓度越高，这种作用越显著。由图9B可知，D-gal 诱导的神经毒性损伤会显著性升高模型小鼠脑组织MDA的水平(P < 0.05)，模型小鼠接受马齿苋水提液治疗后，MDA的水平会显著性升高，马齿苋水提液浓度越高，这种作用越显著。

	A
	B

图9.马齿苋水提液对脑组织SOD活性和MDA水平的影响（A.马齿苋水提液对脑组织SOD活性影响，B.马齿苋水提液对脑组织MDA水平影响。所有的数据均经过三次独立的实验，Lanes 1–5代表对照组，D-gal 模型组，马齿苋水提液分别灌胃2.5、5和10 g·mL-1。(**P < 0.05 vs.对照组； ##P < 0.05 vs. 模型组)

3.3马齿苋水提液对模型小鼠脑组织端粒长度、端粒酶活性的影响

3.3.1Southern blot杂交分析  由图10A，B(典型的DNA端粒Southern blot图)可知，与对照组比较，马齿苋水提液不同浓度作用组对模型小鼠脑组织端粒长度显著增加。

3.3.2端粒酶活性的检测  由图10C可知，与对照组比较，马齿苋水提液不同浓度作用组端粒酶活性显著增强，结果表明马齿苋水提液能明显上调模型小鼠脑组织端粒酶活性。

C

3.4马齿苋水提液对p21waf1、p53基因表达的影响   p21waf1是周期素依赖性蛋白激酶，在细胞生长抑制中其重要作用，我们推测马齿苋水提液有可能在p21waf1基因表达上其中作用，并通过western blot 和real-time RT-PCR证实不同浓度马齿苋水提液在同样的小鼠脑组织p21waf1基因的mRNA和蛋白表达具有显著性差异，p21waf1基因显著下调(图11)。

对于p21waf1的调节有p53依赖和p53非依赖途径，我们检测了脑组织的p53的蛋白和mRNA的表达，发现p53基因表达没有变化(图11)，说明马齿苋水提液抑p21waf1基因表达为p53非依赖途径，我们由此推测马齿苋水提液上调端粒长度、端粒酶活性依赖p21waf1基因调节，但非p53依赖途径。

3.5对肝脑组织显微结构的影响  高质量浓度治疗组小鼠大脑皮层同一视野神经元数量增加，核仁清晰，尼氏小体增多(图12)，肝索清晰，细胞核大，核仁明显，染色质丰富。预防治疗各组镜下脑组织单位面积神经元数量随马齿苋质量浓度的增加而有所增加，并存在剂量效应关系，但与模型组相比没有统计学差异( P > 0.05)。与模型组相比核浆比与肝细胞核面积均有增高趋势，其中核浆比两两比较结果是：治疗组的低质量浓度和高质量浓度组与模型组差异有显著性(P < 0.05)，说明马齿苋可能对正常肝组织细胞有促进再生作用。

表14 马齿苋水提液对小鼠脑神经元数量、核浆比与肝脏细胞核面积的影响（±s，n=8）

组别	脑神经元/1·mm-2	核浆比	核面积/10-5·mm-2
低质量浓度	5476±249a	0.16±0.06b	1.54±0.04
中质量浓度	5587±146a	0.155±0.018	1.32±0.06
高质量浓度	5679±665a	0.195±0.016b	1.28±0.06
正常对照组	6345±396b
模型组	5246±224a	0.14±0.05	1.04±0.08

（注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05）

.05）